闻剑飞刘玉倩王海涛赵斌袁克星

《河北师范大学学报(自然科学版)》2009年02期

【作者单位】：河北师范大学体育学院

收稿日期：2008-10-15

基金项目：国家自然科学基金(30700390)；河北师范大学博士基金(L2005828)

【摘要】：

线粒体呼吸链是运动内源性活性氧(ROS)产生的主要来源，内源性ROS产生增多，可导致脂质、蛋白质及核酸等物质的氧化损伤。研究表明，ROS产生可引起质子漏，质子漏增加可降低ROS生成，提示ROS与质子漏之间存在一种反馈回路；解偶联蛋白(UCPs)参与了这种反馈调节，但其确切分子机制尚不清楚。从运动中线粒体ROS产生及其机制等方面进行了综述。

机体在有氧代谢过程中会产生一类具有较活泼化学性质的含氧自由基及其衍生物———活性氧(reactive oxygen species，ROS)，这类物质包括超氧阴离子(O2·-)、单线态氧(1-O2)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、脂质过氧自由基(LOO·)等。在正常情况下，机体内ROS产生和清除处于动态平衡。研究表明，急性剧烈运动时，机体内清除ROS的能力不足以平衡运动应激情况下产生的ROS时，可引起运动性内源ROS产生增多，导致脂质、蛋白质及核酸等物质的氧化损伤。线粒体是运动中能量供应的“动力工厂”，也是运动中内源性ROS产生的主要部位。本文中，笔者从线粒体ROS产生部位及调节机制等方面进行了综述。

1运动中活性氧产生的实验研究

1．1运动中活性氧产生的直接证据

1982年，Davies等初次应用电子自旋共振技术(electron spin resonance，ESR)直接证实了力竭运动后肝脏、肌肉中自由基明显增多的现象，从而找到了运动诱发ROS生成增多直接的证据。随后，陈英杰等也应用ESR技术观察到运动后骨骼肌中自由基信号增加。随着研究方法和仪器的更新，近年来的研究也为运动中ROS产生的机理提供了直接证据。cArdle等通过培养H-2kb肌细胞(一种骨骼肌成肌细胞，来源于tsA58型鼠)，用还原型二氯荧光素(DCFH)探针直接测定H-2kb细胞在电刺激前、中、后ROS的产生，研究表明，在安静时DCFH的氧化速率未发生变化，而在持续10min的电刺激后，DCFH的氧化速率增加了4倍，且刺激结束后仍然保持较高的速率；研究还表明，当给予过氧化物清除剂1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)时，可减少DCFH氧化生成的H2O2。Bejma等以青年和老年鼠在一次力竭运动后骨骼肌ROS的产生的研究也表明，剧烈运动使青年鼠DCFH氧化速率增加了38％，老年鼠增加了50％。张勇等采用递增负荷跑台运动研究表明，急性运动中骨骼肌线粒体中ROS生成呈先上升后下降的变化趋势，其中运动至45、90、120min时均较安静时显著升高，于120min达到峰值，随后150min时显著降低。潘红英等以电刺激C2C12细胞使其产生收缩运动为模型，DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS产生的时相变化，研究表明，在刺激60min时ROS的生成速率显著升高，然后缓慢下降，继续刺激到120min时，ROS生成再次升高，随后迅速下降。上述研究采用不同的方法手段直接测定了细胞内ROS产生，为进一步研究运动中ROS产生在生理学和病理学中的生物意义提供了实验依据；但采用ESR技术需要熟练的实验技术和昂贵的仪器，而细胞内植荧光探针在实验过程中易受外界因素的影响，因此，需要进一步探索研究一种准确、简便、经济的方法测定内源性ROS的产生，为后续的科学研究提供方法学基础。

1．2运动中活性氧产生的间接证据

大量研究表明，在进行一次急性有氧运动时，随着耗氧量的激增，内源性ROS大量生成，导致机体氧应激加强，引起脂质、蛋白质及DNA等氧化损伤和机体抗氧化能力下降等，由于ROS的寿命短难以检测，因此，在研究中常用这些氧化底物的终产物或副产品来间接反映ROS产生及其对机体造成的危害程度，包括丙二醛(MDA)，蛋白质羰基含量(protein carbonyl，PC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，总抗氧化能力(T-AOC)等指标，1978年，Dillard等初次报道人以50％至大摄氧量负荷踏车运动1 h后，呼出气中脂质过氧化产物戊烷含量明显增加。随后，国内外学者进行了大量研究，Bejma等研究表明，剧烈运动后骨骼肌脂质过氧化产物MDA增加了20％，氧化型谷胱苷肽(GSSG)的含量增加、GSH/GSSG比值降低。张蕴琨等研究表明，在力竭游泳运动后，小鼠骨骼肌、肝脏中MDA含量显著上升，血清CK、LDH活性显著升高，SOD呈下降趋势。徐冬青等观察力竭运动后大鼠骨骼肌形态学改变与自由基损伤的关系，结果显示，运动后即刻骨骼肌MDA水平更高，运动后24h骨骼肌MDA仍维持较高水平，48h后骨骼肌MDA呈明显下降趋势，但仍高于对照组。Bachur等以三级运动负荷不同持续时间为运动模型观察大鼠骨骼肌中MDA、GSH、VE的变化，结果表明，与安静对照组相比，随着运动负荷的增加和持续时间的延长，大鼠骨骼肌MDA水平逐渐增加，GSH、VE浓度在不同负荷下降低程度不同，在小负荷运动中以GSH降低为主，随负荷增加VE浓度逐渐降低。另外，大量研究表明，补充抗氧化剂可提高机体清除ROS的能力，降低氧化应激引起的损伤。You等报道大鼠补充VC+VE 2周后，下坡跑，运动后2h比目鱼肌、股中肌及血浆中PC浓度显著低于对照组。Li等以过度运动损伤模型观察补充Cu/Zn-SOD对骨骼肌氧化损伤影响的研究表明，补充Cu/Zn-SOD组在第3、7d血浆SOD、GSH-Px总抗氧化能力(T-AOC)与对照组相比显著升高，MDA、CK的含量显著降低。

另有研究表明，由运动引起的氧化应激产物无显著性变化。Hoffman等研究不同强度下骨骼肌的过氧化反应，以11名男子运动员为研究对象，在60％和90％至大负荷的运动强度下进行4组蹲举练习，结果显示在2种强度的运动中血浆MDA浓度无显著性变化，研究认为MDA浓度的变化独立于运动强度。造成这种差异的原因可能与研究对象、运动方式等不同有关。总之，急性运动引起的ROS大量生成，机体抗氧化能力下降，导致组织氧化应激加强，其代谢终产物或副产物增多，已被大量实验所证实。

2运动中活性氧产生的机制研究

2．1线粒体呼吸链是活性氧产生的重要来源

在机体物质和能量代谢过程中，能源物质经各自代谢途径进入线粒体，经三羧酸循环逐步脱氢，终在线粒体呼吸链通过各种酶和辅酶的催化下与氧分子结合生成水，同时在此过程中偶联着能量的生成与利用、转移。Indo等以鱼藤酮、3-硝基丙酸、抗霉素A、氰化钠等物质抑制线粒体呼吸链研究表明，当呼吸链抑制时ROS大量生成。Schonfeld等研究表明，在顺呼吸链条件下，ROS产生增加与呼吸链电子传递抑制呈线性关系，复合物Ⅰ、Ⅲ等部位是线粒体内源性产生的主要部位。St-Pierre等通过加入不同底物和抑制剂来测定大鼠骨骼肌、心肌、肝脏线粒体中ROS的产生，研究显示，加入棕榈酸肉碱时骨骼肌、心肌线粒体中有过氧化物大量生成；当用鱼藤酮(一种呼吸链抑制剂)抑制复合物Ⅰ时，发现过氧化物大量生成，提示复合物Ⅰ是ROS产生的部位之一。另有研究认为，CoQ是线粒体呼吸链重要组成部分，也是ROS产生的主要部位之一，电子经CoQ传递时会引起半醌(QH·)的产生，QH·可与氧分子作用生成O2·-。进行运动时线粒体QH·转运速率大大加快，这就为生成较多的活性氧创造了条件。Quinzii等研究表明，在原发性CoQ10缺乏造成呼吸链功能障碍中，ATP合酶受到抑制，ROS产生增加，引起脂质和蛋白质氧化损伤。

2．2活性氧产生机制——电子漏与质子漏

在线粒体呼吸过程中，电子传递中途“漏出”少量电子直接单价还原氧分子形成O2·-，即线粒体电子漏(electron leak)，研究表明，线粒体呼吸链电子漏是运动性内源ROS产生的重要来源。在运动时，由于机体代谢增加，耗氧量激增，进入呼吸链的氧还原量增加，电子漏出呼吸链概率增加，引起O2·-生成速率增加。文献研究表明，运动后骨骼肌线粒体O2·-生成显著增高，脂质过氧化显著增加，说明电子传递过程中电子漏形成的O2·-是运动性内源ROS的重要来源。若电子传递链过程中泵出的质子通过其他途径返回线粒体基质，形成“质子漏(protein leak)”，会破坏内膜两侧的电化学梯度，使ATP生成受到抑制。目前，质子漏现象发生的分子机制尚不清楚。刘树森等提出线粒体态4呼吸中的电子漏产生的O2·-可能作为内源性质子载体，即“电子漏引起质子漏学说”。时庆德等在运动性疲劳的线粒体膜分子机制的研究显示，O2·-生成增加、态4呼吸速率明显加快、磷氧比显著下降，表明力竭性运动后大鼠骨骼肌线粒体电子漏导致线粒体质子漏增多，是运动性疲劳状态下线粒体氧化磷酸化偶联程度下降的重要因素，实验结果支持电子漏引起质子漏假说。研究认为，活性氧产生与质子漏之间存在一个反馈回路。线粒体在电子传递过程中“漏出”的少量电子直接单价还原氧分子形成O2·-，诱导质子漏，导致氧化磷酸化解偶联，抑制ATP的生成。但此过程可使线粒体内膜跨膜电位不再升高，而维持在适宜的水平，因此电子漏途径产生的ROS也是保护细胞的调节机制之一。

2．3活性氧产生的反馈调节——解偶联蛋白

解偶联蛋白(UCPs)是存在于线粒体内膜上的一种转运蛋白，与线粒体能量代谢、活性氧生成及脂肪代谢有关。近年来研究表明，UCPs家族中UCP3主要分布在骨骼肌线粒体中，与运动密切相关，Zhou等研究发现，急性跑台运动30min即刻大鼠骨骼肌UCP3mRNA表达迅速增加，运动20min后达到安静时的7倍，而UCP3蛋白在运动30min即刻也显著升高。氧化磷酸化的“温和解偶联”(mild uncouplig)是调节ROS产生潜在机制，这种调节机制与解偶联蛋白(UCPs)有关。Echtay等研究表明，在线粒体呼吸链ROS产生过量时，可激活线粒体内膜上的UCPs，作为一个反馈的应答并通过UCPs轻度的解偶联作用降低ROS生成，保护线粒体不受氧化损伤。

近年来研究表明，UCPs可诱导线粒体内膜质子导性增强，研究认为，由电子传递链产生的O2·-能够激活UCPs的质子导性，引起线粒体温和解偶联，ROS可能通过激活UCP3表达与质子漏之间存在一个准确的反馈调节回路。张勇等研究表明，在ROS递增的同时，运动中UCP3mRNA和蛋白表达水平也呈相似趋势，认为UCP3表达增加可加大线粒体呼吸链质子漏，促进呼吸链电子传递，减少线粒体ROS生成及其可能引发的氧化损伤。张桂忠等认为，随着ROS大量生成，其可能通过“ROS-质子漏”和“ROS-UCP3-质子漏”2条途径在运动中线粒体能量转换的准确调控中起“分子开关”作用，并作为始动因素参与了呼吸链电子传递与能量转换的能量分配的反馈调节，调控ATP生成。马国栋等认为，骨骼肌线粒体中UCP3水平的升高，可能增加线粒体内膜质子导性，降低线粒体内膜电位，从而抑制线粒体ROS的过量生成。另有研究发现，UCP3基因敲除鼠，线粒体ROS生成增加，膜电位升高，表明UCP3蛋白能够使膜电位保持在ROS大量产生的阈值之下，避免大量ROS的产生。体外研究表明，骨骼肌细胞中UCP3表达增加，同时脂肪酸氧化(fatty acid oxidalion，FAO)增加和ROS生成减少，提示UCP3与FAO和减少ROS生成有关。研究表明，ROS和脂质过氧化的副产品可激活UCP3引起质子漏，认为是减少ROS生成的一种负反馈调节。Bevilacqua等对雄性FBNF1型鼠进行长期能量限制(calorie restriction，CR)的研究表明，经12个月和18个月后，线粒体中H2O2生成和氧化损伤降低，肌肉中UCP3含量增加；线粒体呼吸链质子漏减少但无显著性变化。线粒体ROS的生成可能通过激活UCPs表达引起质子漏，进而抑制ROS生成，但其调控机制尚需深入研究。

3小结

近年来，关于线粒体ROS的研究取得了较大进展，尤其在ROS、电子漏与UCPs之间信号调节机制的研究，为线粒体ROS领域的研究开阔了新的视野，推动了运动引起的氧化应激及机体抗氧化能力等方面的研究。在线粒体ROS产生及调节的分子机制和确切的生理学意义等方面仍需进一步研究。